روشهای معمول مولکولی غربال کردن ژنوم

روشهای معمول مولکولی غربال کردن ژنوم

تفاوت در تظاهر بیان ژن در تمامی مراحل رشد موجود از تولد تا مرگ اتفاق می افتد. شناسایی ژن های تظاهر یافته، در شناخت عمل ژن و نیز در شناخت سازوکارهای مولکولی یک سیستم بیولوژیک به ما کمک خواهد کرد. غربالگری ژنوم یک عامل پیچیده است که هدف نهایی آن، بررسی تغییرات در سطح رونوشت هاست. تا سالهای اخیر ابزارهای مورد نیاز برای تعیین ژنهای مسئول ایجاد تفاوت ژنتیکی بین حیوانات و جمعیت ها در دسترس نبودند. هم اکنون طرح ها، مدل ها، روشهای تجزیه و تحلیل آماری و الگوی بیان رونوشتها و آنالیز ژنومیکی مختلفی برای داده های حاصل از این طرح ها و روشها ایجاد شده است. ادامه مطلب را ببینید...  

 چندین روش آماری برای ردیابی ژنهای عمده پایه گذاری شده است که از آن جمله می توان به روشهای مبتنی بر آزمون نرمال بودن داده ها، آزمون بارتلت، آزمون فین  و آزمون مختلط اشاره نمود.

برخی از روشهای مولکولی و آنالیز ژنومی نیز در ادمه مطلب ذکر گردیده است.

روش Differential Display-RTPCR: در این روش به دلیل اینکه ژنوم با یک آنزیم محدودکننده برش داده می شود تعداد قطعات بسیار زیادی بدست می آید که تفکیک آنها بسیار مشکل است. تعداد زیادی cDNA با اندازه های مشابه بدست می آید و باندها با هم تداخل پیدا می کنند. اشکال دوم این است که جهش های نقطه ای روی نواحی تشخیص آنزیمهای برشی تاثیرگذارند و الگوهای باندی متفاوتی بین دو فرد ایجاد می کنند که در اینصورت، نتایج این روش در حد بالایی مثبت کاذب می باشد.

روش RNA Arbitrarily PCR: همانند روش قبلی می‌باشد با این تفاوت که در مرحله اول نیز آغازگرهای اختیاری استفاده می‌شود. بنابراین، باز هم مشکلات ناشی از اختصاصیت پایین اتصال آغازگر وجود دارد.

روش cDNA-AFLP: برای برطرف کردن مشکلات دو روش فوق، روش cDNA-AFLP تحت شرایط PCR دقیقتر ابداع شد و با استفاده از آن به بررسی الگوی بیان ژنها پرداخته شد. مزیت عمده این روش نسبت به دو روش قبلی، در ابتدا ناشی از هیبریداسیون دقیقتر آغازگرها است که در نتیجه افزودن آداپتورهای عمومی به هر یک از دو انتهای قطعات برش خورده که بعداً جایگاه اتصال آغازگر بکار می‌روند، می‌باشد. این امر سبب می‌شود که اتصال اشتباه و غیراختصاصی آغازگر خیلی نادر و تنها در مواردی که میزان رونوشتها بی‌نهایت بالا است، اتفاق بیافتد. بنابراین، الگوی باندی cDNA-AFLP تا حد زیادی تکرارپذیر و تقریباً عاری از باندهای مثبت دروغین می‌باشد.

به طور کلی این روش حساسیت و تکرارپذیری مناسبی دارد، همانند AFLP ژنومی، نیاز به اطلاعات قبلی از توالی ژنومی موجود مورد آزمایش ندارد، با میزان خیلی پایین مواد اولیه قابل اجرا است و ارتباط خوبی بین نتایج حاصل از آن با نتایج روشهای مورد استفاده برای تأیید بیان افتراقی ژنها نظیر نوردن بلات وجود دارد.

روش Microarray: اساس کار آرایه ها بدین صورت است که کاوشگرها بصورت لکه هایی روی غشاء نایلونی یا نیتروسلولوزی قرار داده شده و مخزن RNA های هدف و یا cDNA، نشاندار شده و از غشاء عبور داده می شود. اگر قطعه هدف با کاوشگر روی غشاء مکمل باشد، هیبرید می شود و در نتیجه مقدار و غلظت RNA هدف قابل تعیین است. RNA هایی که باند نشده اند از روی غشاء شسته می شوند. اگر بخواهیم سطح RNA های سلول را در هر زمان با گروه دیگر یا زمان دیگر مقایسه کنیم نیاز به ریزآرایه می باشد.

روش Amplification Suppression: در این روش، مراحل تکثیر به راحتی انجام می شود ولی استفاده از لینکرها تا حدودی مشکل است. این روش، ساده، سریع و ارزان است. اساس این دسته روشها، تکثیر cDNA ای است که تنها در یکی از دو گروه مقایسه شونده وجود دارد. اینکه چگونه از تکثیر بقیه cDNA ها جلوگیری شود بستگی به نوع روش انتخابی دارد. تکنیک SAGE در این گروه قرار می گیرد. برای طراحی آرایه cDNA نیاز به دانستن توالی ژنوم میزبان یا حداقل سهم بزرگی از آن می باشد. اشکال اصلی این روش این است که اگر توالی ژنوم موجود نامعلوم باشد استفاده از این روش بسیار محدود می گردد. اشکال دیگر اینکه نیاز به حدود μg 5 از mRNA و چیزی حدود μg 500 از RNA کل می باشد. بدین منظور به حجم بزرگی از بافت نیاز است که ممکن است حالت همگنی بافت دچار مشکل شود.

استفاده از آنالیز ژنومی QTL

 روش های مختلفی برای مکان یابی QTL  وجود دارد که ساده ترین آنها استفاده از روش تک نشانگری است. این روش بر اساس مقایسه های میانگین فنوتیپی گروه های نشانگری استوار است. بنابراین می توان در هر بار، داده های فنوتیپی را با یک نشانگر مورد تجزیه و تحلیل قرار داد. در این صورت هر بار پیوستگی QTL با یک جایگاه ژنی نشانگری بررسی می شود و در نتیجه آزمون برای هر یک از نشانگرها مستقل از نشانگر های دیگر انجام می گیرد. در این روش در صورتی که میانگین فنوتیپی صفت مورد مطالعه در کلاس های ژنوتیپی یک نشانگر متفاوت باشد، گفته می شود QTL در اطراف آن نشانگر قرار گرفته است.

استفاده از آنالیز ژنومی GWAS

این روش جهت یافتن تفاوت های ژنتیکی در افراد یک جمعیت کاربرد داشته و می توان ارتباط هر نوع تنوع ژنتیکی را با صفت مورد مطالعه بررسی نمود. در این گونه مطالعات مبنای مقایسه DNA افراد بوده و جمعیت مورد مطالعه به دو گروه فنوتیپی شامل گروه آزمایشی و گروه شاهد تقسیم بندی می شود. چنانچه یک تنوع ژنتیکی فرکانس بیشتری در گروه آزمایشی نسبت به شاهد داشته باشد گفته می شود که این صفت با تنوع ژنتیکی یافت شده در ارتباط است. استفاده از GWAS برای یافتن ژن های کاندید بطور گسترده ای متداول شده است.